風疹病毒（RV）熒光探針PCR核酸檢測試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：風疹病毒（RV）核酸檢測試劑盒(RT-PCR 熒光探針法)

Name ：Diagnostic Kit for Rubella Virus RNA (RT-PCR Fluorescence Probing)

【包裝規(guī)格】48 份/盒

【預期用途】

本試劑盒適用于檢測的咽拭子標本等標本中風疹病毒 RNA，適用于風疹病毒感染的輔助診斷。其檢測結(jié)果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對風疹病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對風疹病毒 RNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

酶液 50μl×1 管

RV 反應液 1.0ml×1 管

RV 陽性質(zhì)控品 50μl ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μl ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 5 次，

有效期 12 個月。

【標本采集】

采集病人的咽拭子標本，應使用采樣拭子，適度拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部

位，應避免觸及舌部；迅速將拭子放入標本采集管中，旋緊管蓋并密封，以防干燥。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標

本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應體系設(shè)置為 25ul；熒光通道選擇：

檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿

選擇 ROX 參比熒光。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號

1 1cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycle

94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲

線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15

范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value

值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

取 100uL 拭子標本于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取

法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性

對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑 RV 反應液 酶液

用量 20μl 1μl

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl，分別加入相應的反

應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

6. 檢測方法的局限性

樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；

以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

8. 產(chǎn)品性能指標

陰陽性參考品符合率：5 份陽性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合率

為 100％。

低檢測限：5.0×102copies/ml。

精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。

【注意事項】

所有操作嚴格按照說明書進行；

試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；

反應液應避光保存；

反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

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