魚類神經(jīng)壞死病毒（VNN）熒光PCR檢測試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：魚類神經(jīng)壞死病毒（VNN）核酸擴(kuò)增檢測試劑盒(PCR 熒光探針法)

Name ：Fish Neuronal Necrosis Virus (VNN) Nucleic Acid Amplification Kit (PCR Fluorescent Probe Method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測全血等樣本中的魚類神經(jīng)壞死病毒（VNN），用于魚類神經(jīng)壞死病毒（VNN）感染的輔助診斷，其檢測結(jié)果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對魚類神經(jīng)壞死病毒（VNN）特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對魚類神經(jīng)壞死病毒（VNN）的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件和有效期】

試劑盒保存于-20±5℃，有效期 12 個月；

避免反復(fù)凍融，凍融次數(shù)不超過 5 次；試劑開瓶后，在室溫條件下放置時間不

應(yīng)超過 8 小時；運輸采用干冰（或者冰袋）保持低溫，運輸時間不應(yīng)超過 4 天。試

劑盒生產(chǎn)日期見產(chǎn)品標(biāo)簽。

【標(biāo)本要求】

標(biāo)本采集：用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管

保存運輸：上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6 個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.1樣本前處理1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

取抗凝血下層血細(xì)胞 50uL，加入 100uL 雙蒸水吹勻

1.2DNA 提取

1) 對上述處理好的標(biāo)本加入等體積核酸提取液（固體標(biāo)本加入50uL核酸提取液），100℃恒溫處理 10 分鐘，13,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mlEP 管，-20℃保存；

2) DNA 的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl，分別加入相應(yīng)的反

應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35.0<Ct 值≤37，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為 35.0<Ct值≤37，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>37 或無 Ct 值。

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；

以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

8. 產(chǎn)品性能指標(biāo)

陰陽性參考品符合率：8 份陽性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合率為 100％。

低檢測限：2.0×102copies/ml。

精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(shù)（CV）均≤3%。

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